通用实验步骤

WB、IHC、IF、IP、Co-IP、ELISA 及细胞培养等通用参考流程；与产品页「实验方案」同源，具体条件请结合说明书与预实验优化。

抗体检测

以下为免疫检测类通用参考流程（适用于抗体类产品）；具体条件请结合说明书与预实验优化。

WB 实验步骤

  1. 样品制备：使用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的裂解液提取总蛋白，冰上裂解 30 min，12 000×g 离心 15 min 取上清，BCA 法测定蛋白浓度。
  2. SDS-PAGE：制备分离胶与浓缩胶，按 20–40 µg/孔上样，恒压电泳至溴酚蓝到达胶底。
  3. 转膜：湿转或半干转至 PVDF 膜，转膜条件按分子量调整（mTOR 家族约 250–300 kDa，宜延长转膜时间）。
  4. 封闭：5% BSA 或脱脂奶粉室温封闭 1 h，或 4°C 过夜。
  5. 一抗孵育：将 本产品 按推荐稀释度稀释于封闭液中，4°C 过夜或室温 2 h；洗涤 TBST 3×5 min。
  6. 二抗孵育：HRP 标记二抗按说明书稀释，室温 1 h；洗涤 TBST 3×5 min。
  7. 显影：ECL 化学发光检测；胶片或成像系统采集图像，ImageJ 等软件分析条带。

IHC 实验步骤

  1. 脱蜡与水化：石蜡切片二甲苯脱蜡 2×10 min，梯度乙醇至水。
  2. 抗原修复：柠檬酸缓冲液（pH 6.0）微波或高压热修复，自然冷却后 PBS 洗涤。
  3. 封闭内源性过氧化物酶：3% H₂O₂ 室温 10 min，PBS 洗涤。
  4. 封闭非特异结合：5–10% 正常血清或 BSA 室温 30–60 min。
  5. 一抗孵育：本产品 按推荐稀释度于 4°C 过夜；次日 PBS 洗涤。
  6. 二抗及显色：生物素-链霉亲和素系统或聚合物二抗，DAB 显色；苏木素复染、脱水封片。
  7. 显微镜观察并拍照；阴性对照建议省略一抗或使用同型对照。

IF 实验步骤

  1. 细胞爬片或冰冻切片固定：4% 多聚甲醛室温 10–15 min，PBS 洗涤。
  2. 通透：0.1–0.5% Triton X-100 室温 10 min（胞内靶点需要；膜蛋白可缩短或省略）。
  3. 封闭：5% BSA 室温 1 h。一抗：本产品 按推荐稀释度 4°C 过夜或室温 2 h。
  4. 荧光二抗：避光室温 1 h；DAPI 复染细胞核 5 min。
  5. 抗荧光淬灭封片剂封片，共聚焦或荧光显微镜观察；注意避光保存。

IP 实验步骤

  1. 样品：1–3 mg 总蛋白裂解液（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂），预清除可选 Protein A/G 珠 30 min。
  2. 抗体-珠偶联：本产品 与 Protein A/G 珠 4°C 旋转孵育 2–6 h 或过夜（或先与裂解液孵育后再加珠）。
  3. 免疫沉淀：加入细胞裂解液 4°C 旋转 2–4 h；低速离心收集珠，冷裂解液洗涤 4–6 次。
  4. 洗脱：2×SDS 上样缓冲液煮沸 5–10 min，离心取上清进行 SDS-PAGE / WB 分析。
  5. 对照：建议设置同型对照 IgG IP 与全细胞裂解液 Input。

Co-IP 实验步骤

  1. 裂解：温和非变性裂解液（如含 0.5–1% NP-40/Triton X-100，并加蛋白酶/磷酸酶抑制剂）冰上裂解，离心取上清；保留 Input（约 5–10% 裂解液）。
  2. 预清除（推荐）：裂解液与 Protein A/G 珠 4°C 旋转 30–60 min，离心取上清，降低非特异结合。
  3. 诱饵抗体 IP：用 本产品（诱饵/靶蛋白抗体）与裂解液 4°C 旋转 2–4 h 或过夜；再加 Protein A/G 珠继续孵育 1–2 h（也可先将抗体与珠偶联）。
  4. 洗涤：低速离心收集珠，用冷裂解液或洗涤缓冲液轻柔洗涤 4–6 次，尽量吸尽上清。
  5. 洗脱与检测：2×SDS 上样缓冲液煮沸 5–10 min；SDS-PAGE / WB 分别检测诱饵蛋白与候选互作蛋白（互作伙伴用另一抗体检测）。
  6. 对照：同型对照 IgG Co-IP、Input；必要时用已知互作对作阳性对照，或敲低/敲除诱饵蛋白作阴性对照。

ELISA 实验步骤

  1. 包被：将捕获抗体或抗原按说明书包被于酶标板，4°C 过夜或 37°C 2 h；洗涤液洗板。
  2. 封闭：1–5% BSA 或脱脂奶粉 37°C 1–2 h；洗板。
  3. 加样：加入梯度标准品与待测样品，37°C 1–2 h；洗板。检测抗体：加入 本产品 或配对检测抗体，37°C 1 h；洗板。
  4. 酶标二抗及底物：TMB 显色，酶标仪读取 OD450；绘制标准曲线并计算样品浓度。

细胞培养

以下为细胞培养相关参考流程（常规维持、复苏、传代与冻存）；具体条件请结合本页完全培养液/冻存液、细胞类型与预实验优化。

细胞培养（常规维持）

  1. 培养箱、生物安全柜与耗材灭菌准备；完全培养液及缓冲液预热至 37℃（避免冷冲击）。
  2. 使用 按说明书配制的完全培养基（与 本产品 配套）；记录批次。推荐气体条件：37℃、5% CO₂。
  3. 接种密度参考：按细胞类型与器皿调整；轻柔混匀避免气泡；避免频繁开关培养箱门。
  4. 培养期间定时镜检形态与汇合度；多数贴壁株可每 2–4 天半量或全量换液（依密度与培养基颜色调整）。
  5. 发现污染迹象立即隔离并按实验室 SOP 处理；记录代次与换液日期。

细胞复苏

  1. 到货后尽快复苏；若需暂存，仅可置于液氮气相，避免仅 −70/−80℃ 长期保存（易导致活率下降）。
  2. 自液氮取出冻存管，立即于 37℃ 水浴轻柔摇动约 1–2 min，至仅剩微小冰晶；瓶盖/密封圈勿浸入水中以防污染。
  3. 超净台内用 70% 乙醇擦拭管壁后开启；将内容物转移至含约 9 mL 预温 按说明书配制的完全培养基（与 本产品 配套） 的离心管，沿管壁缓慢加入并轻混，减轻 DMSO 与渗透压冲击。
  4. 约 125×g 离心 5–7 min（或按实验室等效低速条件），弃上清；用新鲜完全培养液轻柔重悬。
  5. 接种前可将已加完全培养液的培养瓶先放入培养箱约 15 min，使 pH 平衡至约 7.0–7.6，避免复苏后过度偏碱。
  6. 台盼蓝或自动计数后接种至 T25 或 T75；次日镜检贴壁与碎片，必要时换液去除残留冻存保护剂与死细胞。

细胞传代

  1. 传代前镜检；本类贴壁细胞建议亚汇合传代（勿追求完全铺满）。传代比例参考：常见 1:3–1:6（依汇合度调整）；接种密度参考：按细胞类型与器皿调整。
  2. 吸弃旧培养基。用无钙镁 PBS 或少量胰酶-EDTA 短暂润洗，去除残留血清（血清含胰酶抑制剂）。
  3. 加入适量 0.05–0.25% 胰酶或 trypsin-EDTA（以覆盖细胞层为准），倒置显微镜下观察至细胞变圆、可吹散，通常约 5–15 min；难消化时可置 37℃ 促进解离。等待期间勿拍打培养瓶以免结团。
  4. 加入 2–3 倍体积含血清的 按说明书配制的完全培养基（与 本产品 配套） 中和，轻柔吹打成悬液；取样计数并记录代次。
  5. 按目标比例分种至新培养瓶，补充完全培养液，于 37℃、5% CO₂ 培养；记录传代比例与日期。

细胞冻存

  1. 选择亚汇合、状态良好的贴壁细胞；按传代流程消化、中和并计数，计算所需冻存管数。
  2. 配制冻存液：完全培养液 90% + DMSO 10%（可按 SOP 调整）；冰上或 4℃ 预冷备用。ATCC 对本系列相关株亦常用完全培养液 + 5% DMSO；可按实验室 SOP 在 5–10% DMSO 间优化。
  3. 离心收集细胞，弃上清，用冻存液重悬至推荐密度（常见约 1×10⁶–5×10⁶ 细胞/mL，按细胞类型调整）。
  4. 分装至冻存管，标注货号、株名、代次与日期；程序降温或异丙醇冻存盒于 −80℃ 过渡后，尽快转入液氮气相长期保存。

小分子抑制剂

以下为小分子抑制剂类通用参考流程（溶解、细胞处理、储存）；浓度与时间请结合细胞模型与预实验优化。

溶解与储液配制

  1. 按溶解度数据选择溶剂（常用 DMSO）；称取 本产品，配制高浓度储液并分装，避免反复冻融。
  2. 储液建议 −20℃ 或更低保存；使用前平衡至室温，短暂离心收集管壁液体。
  3. 工作液用培养基稀释至终浓度，控制溶剂终浓度（如 DMSO ≤0.1%），并设置溶剂对照。

细胞处理参考

  1. 接种细胞至适宜密度，贴壁稳定后再加药（悬浮细胞按实验窗口调整）。
  2. 将 本产品 工作液加入细胞培养体系，轻柔混匀；处理时间 1–72 h 依读出指标优化。
  3. 收取样品进行增殖、凋亡、通路蛋白或功能学检测；记录浓度–效应关系。

储存与操作注意

  1. 固体与储液避光防潮；注意开封后吸湿与降解。
  2. 操作人员按化学品规范佩戴防护；废弃物按实验室危废流程处理。
  3. 仅供科研使用（RUO），非临床诊断或治疗用途。

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