适用场景
经尾静脉注入 MDA-MB-231（常 Luc 标记），绕过原发灶与出瘤，评价循环存活、肺外渗与肺定植。可选用肺亲和亚系 LM2。本页按新手清单编写，不能替代 IACUC 与注射培训。
仅供科研（RUO），非临床诊疗。必须先有动物伦理（IACUC）批件与 SPF 设施。本页不提供麻醉/镇痛剂量，不替代兽医 SOP。无批件请不要做。尾静脉不是侧腹皮下，也不是第 4 脂肪垫；悬液禁止 Matrigel。
用途一览
要肺定植走本页；要完整 cascade 请换原位后自发转移；要骨/脑请换心内或脑协议。不要把侧腹或脂肪垫 SOP 套到静脉。
流程是否一致
肺定植与 LM2 比较共用本页静脉骨架；自发转移与骨/脑请换协议。
| 用途 | 与傻瓜流程关系 | 相对核心 SOP 的差异 |
|---|---|---|
| 实验性肺定植 / 抗转移初筛 | 共用核心 SOP | 核心傻瓜步骤即本页。 |
| LM2 vs 亲本 | 核心 + 附加模块 | 同一针法；LM2 细胞数更低，随访更短。 |
| 原位后自发转移 / 心内骨 / 脑 | 换路径 / 协议 | 脂肪垫、左心或颅内，非尾静脉。 |
一句话造模
伦理批件 → Luc/亲本或 LM2 准备 → 尾静脉注射 → BLI/肺灶监测 → 终点肺病理。
D−1 / D0 时间轴
1. D−7 至 D−3
免疫缺陷鼠 SPF 检疫；确认雌性、周龄；写明呼吸窘迫人道终点；核对 IACUC。
2. D−1
细胞换液，保持 85–90% 汇合；称重；Luc 株确认报告基因仍在。
3. D0 上午
PBS 洗 → 胰酶 → 中和离心 → PBS 重悬 → 计数（活力≥90%，无团块）。
4. D0 配液
按配方卡用 PBS 调到 100 μL/只（+ 约 50%）；禁止 Matrigel。
5. D0 注射
加热扩管 → 保定 → 26G 侧尾静脉 100 μL。无皮下白丘。
6. D0 注射后
观察呼吸；Luc 可即刻 BLI 排除未种上者[[1]]。记细胞数、亚系与代次。
7. D+3 起
体重 + 呼吸；Luc 按计划 BLI。触发人道终点则停止。
流程概览
以下为该场景专用流程图（在核心接种骨架上调整宿主/给药或影像/读出）。
- 伦理批件 + 免疫缺陷鼠检疫（呼吸窘迫终点）
- 扩培 MDA-MB-231 ± Luc/LM2（记代次；T75 见扩培表）
- 单细胞悬液计数（活力≥90%，无 Matrigel）
- 尾静脉注射（加温扩管，26G，100 μL）
- BLI / 体重 / 呼吸监测
- 终点肺取材病理
新手操作包（文献案例）
流程图按钮可弹出对应表。以下为全套清单，按顺序准备即可。
开箱清单（尾静脉肺定植，按每只鼠规划）
有货号的链到本站产品。本路径是静脉单细胞悬液，不要带 Matrigel（栓肺）。培养基以 MC-h133 说明书为准。[1][2][3]
| 物品 | 每只鼠 / 本研究 | 说明 |
|---|---|---|
| MDA-MB-231 或 LM2 亚系 MC-h133 | 1 支起扩 | STR / 支原体合格；记代次；LM2 肺定植远强于亲本[1] |
| 胎牛血清 FBS（常规培养） MC100 | 完全培养液 10% | 优先常规级 |
| 培养基（DMEM 或 RPMI） | T75 约 15 mL | Minn：高糖 DMEM + 10% FBS[1]；Zhou：RPMI 1640 + 10% FBS[3] |
| 无钙镁 PBS / DPBS | 洗涤 + 重悬 100 μL/只 | 接种悬液勿含血清、勿含 Matrigel[1] |
| 胰酶-EDTA（0.05–0.25%） | T75 约 3–5 mL | 必须打成单细胞，团块会急性栓肺 |
| T75 培养瓶或 10 cm 培养皿 | 见扩培案例表（三档细胞数） | 对数期 85–90% 汇合收获 |
| 1 mL 结核菌素注射器 + 26G ½″ 针 | 每只 1 套 + 备用 | Yang：26G；排出气泡[2]。死腔可大，按约 50% 多配 |
| 加热灯或温水 + 保定器 | 全研究共用 | 扩侧尾静脉；Ring 加热灯约 2 min 后保定[4]。勿烫伤尾部 |
| D-荧光素（Luc 株） | 按成像 SOP | Minn：1.5 mg（15 mg/mL）眶后，2–5 min 内成像[1]。浓度只跟批件/厂家，不从本页发明 |
扩培案例：只数 vs T75（尾静脉三档）
接种配方卡（每只 + 整批；无基质）
本 SOP 常用约 2×10⁵–1×10⁶ / 100 μL PBS，无 Matrigel。LM2 在 2×10³ 即可成灶，亲本 2×10⁵ 常只留惰性残存[1]。Zhou 亲本要肉眼/影像灶用 1×10⁶；1.5×10⁶ 为福利上限。配好后尽快打完。[1][3][4]
| 项目 | 本 SOP（常用） | 文献变体 / 上限 |
|---|---|---|
| 细胞数 / 只 | 亲本约 1×10⁶；LM2 可低至 2×10⁵ 或更低 | Minn 亲本/筛选：2×10⁵；LM2 低至 2×10³[1]。Zhou 亲本 1×10⁶ 出灶，1.5×10⁶ 过重[3]。Ring NSG 1×10⁶[4] |
| 注射体积 | 100 μL（0.1 mL） | Minn 0.1 mL PBS[1]；Yang 100 μL[2]。不要 Dilate 后打 200 μL 除非批件另写 |
| 载体 | 无血清 PBS；禁止 Matrigel | Minn：PBS 洗后重悬[1]。Ring 用培养液 100 μL[4]。基质会堵肺 |
| 整批倍数 | 只数 × 1.5（结核菌素死腔）[2] | 打一只吸一只，减少细胞沉降 |
| 10 只整批（SOP 1×10⁶） | 约 1.5×10⁷（1×10⁶ × 10 × 1.5）→ 见 T75 1×10⁶ 列 | 2×10⁵ 档：约 3.0×10⁶ → 1 瓶 T75 即够 |
| 活力 / 单细胞 | 台盼蓝 ≥90%；镜下无团块 | 低于 90% 或有团块：不注射，退回扩培 |
接种核对卡（侧尾静脉，非侧腹、非脂肪垫）
加温扩管后打入侧尾静脉。本页不给麻醉剂量。无 IACUC 批件者不要做。皮下白丘 = 外渗失败；即刻呼吸窘迫按人道终点。[2][4]
| 核对项 | 通过标准 | 失败时 |
|---|---|---|
| 扩管 | 加热灯或温水至侧尾静脉清晰可见；Yang：扩管成败决定注射成败[2] | 静脉不显：再温、换侧，勿反复盲穿同一点 |
| 保定 | 保定器固定，尾外露；Ring：加热约 2 min 后保定[4] | 挣扎剧烈：停，防针折与空气进入 |
| 针号 / 气泡 | 1 mL + 26G ½″；斜面向注射器刻度；排尽气泡[2] | 有气泡：重新排气。空气栓子可致死 |
| 注射 | 侧尾静脉缓慢推注 100 μL；推注时静脉褪色、无皮下白丘 | 皮下白丘 / 阻力大：外渗，该只记录失败，勿把余量打进组织 |
| 即刻观察 | 回笼后呼吸平稳、活动可 | 喘息、发绀、翻倒：按人道终点 / 兽医 SOP，疑栓子或过载 |
| 当日成像（Luc） | Minn：注射后立即 BLI，排除未种上的鼠[1] | 无胸部信号：该只不入定植组 |
细胞培养卡（MDA-MB-231 / MC-h133）
倒置显微镜（示意 10× 视野）：汇合度是细胞铺满培养面积的百分比。单层铺匀时，镜头里被细胞占住的面积大约就是这个百分比。传代 / 接种取中间幅。点击示意图可放大。
以本站说明书为准。汇合度示意图非真实显微照片。静脉接种必须对数期单细胞。Minn 用高糖 DMEM[1]。
| 项目 | 做法 |
|---|---|
| 培养基 | 说明书优先。Minn：高糖 DMEM + 10% FBS[1]。Zhou：RPMI 1640 + 10% FBS[3]。Ring：DMEM + 10% FBS[4]。ATCC 经典亦见 L-15（注意 CO₂）。 |
| 汇合 85–90%（传代 / 收获） | 倒置镜下细胞约占视野的 85–90%：几乎铺满，仍有细小空隙，未层层叠加。过汇合活力下降，静脉注射更易成栓。Minn 计「viable cells」[1]。 |
| 换液 / 传代 | 每周至少换液 2 次；达 85–90% 即传代，保持对数期。Luc/GFP 株 FACS 富集后须再验证转移表型[1]。 |
| 代次 / 亚系 | 亲本与 LM2 分开记代次，不要混用细胞数。LM2 是体内筛选的肺亲和群体[1]。 |
| 接种日前一天 | 换液；镜检无团块倾向；按只数备足 T75（见扩培表）。 |
失败排查
监测记录字段（可打印抄写）
文献案例对照
本 SOP 亲本常用 1×10⁶ / 100 μL PBS；LM2 用更低剂量。T75 表按 1.5×10⁶ 列保守备瓶，但不要把该剂量当默认。
| 文献 | 宿主 | 细胞数 | 体积 / 针 / 载体 | 读出 |
|---|---|---|---|---|
| Minn 2005[1] | ♀ Balb/c 裸鼠，4–6 周 | 2×10⁵；LM2 可 2×10³ | 0.1 mL PBS；侧尾静脉 | BLI + 大体肺；终点 15 周 |
| Yang 2012[2] | ♀ NOD-SCID，4–6 周 | Luc-MDA-MB-231（章内给体积与针，未在摘要写细胞数） | 100 μL；1 mL + 26G ½″；加热扩管 | 非侵入 BLI 监测肺定植 |
| Zhou 2012[3] | ♀ 裸鼠，4–5 周 | 2×10⁵ / 1×10⁶ / 1.5×10⁶ | 尾静脉（体积未写；本 SOP 对齐 100 μL） | SPECT/CT + HE；1×10⁶ 周 8 出灶；1.5×10⁶ 周 7 即弱 |
| Ring 2020[4] | ♀ NSG，8–10 周 | 1×10⁶ | 100 μL 培养液；加热灯 2 min + 保定器 | 每周 BLI 5 周；对照约 57 天处死 |
- 01【伦理与设施】取得 IACUC 批件；雌性免疫缺陷鼠 SPF 检疫 ≥3–7 天。写明呼吸窘迫、发绀、体重骤降的人道终点。开箱清单与宿主表见上方。仅供科研（RUO）。本页不能替代尾静脉培训与兽医 SOP。
- 02【细胞准备 / 扩培 MDA-MB-231 ± Luc/LM2】STR/支原体合格 MC-h133；亲本与 LM2 分开记代次。D−1 换液；85–90% 汇合收获。Luc/GFP 须验证不影响转移表型[1]。培养卡与 T75 表见上（按 2×10⁵ / 1×10⁶ / 1.5×10⁶ 三档，不要套侧腹备瓶）。[1][2][3]
假设：对数期 T75 约 5×10⁶ 收获；Yang 26G 结核菌素针按 50% 多配（不是侧腹 25G 的 20%）。三档 = Minn 2×10⁵、本 SOP 常用 1×10⁶、Zhou 上限 1.5×10⁶（勿作默认，7 周即可呼吸差）。10 cm 皿面积接近 T75。[1][2][3]
裸鼠（只） 2×10⁵ T75 SOP 1×10⁶ T75 上限 1.5×10⁶ T75 1 1 1 1 2 1 1 1 3 1 1 2 4 1 2 2 5 1 2 3 6 1 2 3 7 1 3 4 8 1 3 4 9 1 3 5 10 1 3 5 倒置显微镜（示意 10× 视野）：汇合度是细胞铺满培养面积的百分比。单层铺匀时，镜头里被细胞占住的面积大约就是这个百分比。传代 / 接种取中间幅。点击示意图可放大。
点击放大空隙大，产量不够，再养一天 几乎铺满，仍有细缝；未堆叠 空隙消失，不宜接种 以本站说明书为准。汇合度示意图非真实显微照片。静脉接种必须对数期单细胞。Minn 用高糖 DMEM[1]。
项目 做法 培养基 说明书优先。Minn：高糖 DMEM + 10% FBS[1]。Zhou：RPMI 1640 + 10% FBS[3]。Ring：DMEM + 10% FBS[4]。ATCC 经典亦见 L-15（注意 CO₂）。 汇合 85–90%（传代 / 收获） 倒置镜下细胞约占视野的 85–90%：几乎铺满，仍有细小空隙，未层层叠加。过汇合活力下降，静脉注射更易成栓。Minn 计「viable cells」[1]。 换液 / 传代 每周至少换液 2 次；达 85–90% 即传代，保持对数期。Luc/GFP 株 FACS 富集后须再验证转移表型[1]。 代次 / 亚系 亲本与 LM2 分开记代次，不要混用细胞数。LM2 是体内筛选的肺亲和群体[1]。 接种日前一天 换液；镜检无团块倾向；按只数备足 T75（见扩培表）。 - 03【单细胞悬液】PBS 轻洗，胰酶消化成单细胞，中和离心后用无血清 PBS 重悬。台盼蓝 ≥90%，镜下无团块。禁止 Matrigel。冰上，尽快注射。配方与 50% 死腔见配方卡。
本 SOP 常用约 2×10⁵–1×10⁶ / 100 μL PBS，无 Matrigel。LM2 在 2×10³ 即可成灶，亲本 2×10⁵ 常只留惰性残存[1]。Zhou 亲本要肉眼/影像灶用 1×10⁶；1.5×10⁶ 为福利上限。配好后尽快打完。[1][3][4]
项目 本 SOP（常用） 文献变体 / 上限 细胞数 / 只 亲本约 1×10⁶；LM2 可低至 2×10⁵ 或更低 Minn 亲本/筛选：2×10⁵；LM2 低至 2×10³[1]。Zhou 亲本 1×10⁶ 出灶，1.5×10⁶ 过重[3]。Ring NSG 1×10⁶[4] 注射体积 100 μL（0.1 mL） Minn 0.1 mL PBS[1]；Yang 100 μL[2]。不要 Dilate 后打 200 μL 除非批件另写 载体 无血清 PBS；禁止 Matrigel Minn：PBS 洗后重悬[1]。Ring 用培养液 100 μL[4]。基质会堵肺 整批倍数 只数 × 1.5（结核菌素死腔）[2] 打一只吸一只，减少细胞沉降 10 只整批（SOP 1×10⁶） 约 1.5×10⁷（1×10⁶ × 10 × 1.5）→ 见 T75 1×10⁶ 列 2×10⁵ 档：约 3.0×10⁶ → 1 瓶 T75 即够 活力 / 单细胞 台盼蓝 ≥90%；镜下无团块 低于 90% 或有团块：不注射，退回扩培 - 04
- 05【尾静脉注射】按接种核对卡：加热扩管、保定、26G、100 μL、排尽气泡、无皮下白丘[2][4]。麻醉剂量只允许来自批件。
加温扩管后打入侧尾静脉。本页不给麻醉剂量。无 IACUC 批件者不要做。皮下白丘 = 外渗失败；即刻呼吸窘迫按人道终点。[2][4]
核对项 通过标准 失败时 扩管 加热灯或温水至侧尾静脉清晰可见；Yang：扩管成败决定注射成败[2] 静脉不显：再温、换侧，勿反复盲穿同一点 保定 保定器固定，尾外露；Ring：加热约 2 min 后保定[4] 挣扎剧烈：停，防针折与空气进入 针号 / 气泡 1 mL + 26G ½″；斜面向注射器刻度；排尽气泡[2] 有气泡：重新排气。空气栓子可致死 注射 侧尾静脉缓慢推注 100 μL；推注时静脉褪色、无皮下白丘 皮下白丘 / 阻力大：外渗，该只记录失败，勿把余量打进组织 即刻观察 回笼后呼吸平稳、活动可 喘息、发绀、翻倒：按人道终点 / 兽医 SOP，疑栓子或过载 当日成像（Luc） Minn：注射后立即 BLI，排除未种上的鼠[1] 无胸部信号：该只不入定植组 - 06
- 07【终点】安乐死后取肺做大体与 HE；影像阴性仍应做组织学（微转移）[3]。本模型不覆盖出瘤；完整 cascade 请换原位后自发转移协议。
- 08【质控】固定品系、性别、周龄、亚系、代次与细胞数；独立重复。失败先查排查表，再考虑改剂量。
试剂 / 材料
| 名称 | 用途 | 浓度 / 用量 |
|---|---|---|
| MDA-MB-231 细胞（MC-h133） | 尾静脉接种（亲本或 LM2） | 本 SOP 亲本约 1×10⁶ / 100 μL PBS；LM2 更低；上限 1.5×10⁶ 不作默认[[3]] |
| 胎牛血清 FBS | 完全培养液 10% | 常规培养优先 MC100 |
| Luc/GFP 标记株（可选） | 活体成像 | 验证不影响转移表型[[1]] |
| D-荧光素（Luc 用） | BLI 底物 | Minn：1.5 mg（15 mg/mL）眶后[[1]]；其余按成像 SOP |
| 受试药物 / 溶剂对照（可选） | 治疗臂 | 按药理方案 |
读出指标
肺转移灶数/面积、BLI 信号、体重、生存期、肺病理。
参考文献（PubMed）
- [1]PMID 16049480 — Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature (2005)
- [2]PMID 22956145 — Mouse models for tumor metastasis. Methods Mol Biol (2012)
- [3]PMID 22737193 — Monitoring Breast Tumor Lung Metastasis by U-SPECT-II/CT with an Integrin α(v)β(3)-Targeted Radiotracer( 99m)Tc-3P-RGD(2). Theranostics (2012)
- [4]PMID 33167919 — EP300 knockdown reduces cancer stem cell phenotype, tumor growth and metastasis in triple negative breast cancer. BMC Cancer (2020)
免责：RUO；须 IACUC；参数按品系与预实验调整，非标准临床操作。红字标签表示亲本株转移终点证据弱或不作为转移模型。