细胞培养 / 类器官 / 食管癌 PDO

食管癌 PDO 建库 protocol

患者来源食管腺癌 / 鳞癌类器官:消化包埋后用胃肠上皮样 niche(Wnt / R-spondin / Noggin / EGF / FGF ± 胃泌素等,亚型分配方)建库;注意 Barrett 上皮污染,做 CK / p53 / EpCAM 质控与药敏。[1][2][3]

适用场景

食管癌 PDO,不是 KYSE / OE33 球体,也不是单纯 Barrett 上皮扩增全程。

用途适合度主要读出说明
EAC 内镜活检 / 切除 PDO 活库与药敏推荐基因组保持、克隆演进与药敏[1][2]Li / Derouet 等证明 EAC 类器官可复现原发灶异质性并支持药敏。
ESCC PDO(鳞癌优化配方)对照鳞状标记 / 药敏与 EAC 分皿分配方;勿混库[[3]]。
把 Barrett 上皮扩增当成 EAC PDO勿混用“肿瘤”药敏假阳性Barrett 可污染建库;形态 / 基因组核对后再下肿瘤结论[[2]]。

一句话造模

食管肿瘤小团 → dome → Wnt/EGF niche(EAC/ESCC 分配方)→ 短期 Y-27632 → 机械传代 → CK/p53 → 药敏。

流程概览

  1. 伦理 + 冷链;记录组织学(EAC / ESCC)、分期与 Barrett 史
  2. 活检或切除标本剔除坏死;胶原酶 ± Dispase 至小团;血性短时裂红(MC427)
  3. 基质胶 dome;按亚型选 EAC 或 ESCC 优化配方(Wnt/Rspo/Noggin/EGF/FGF ± 胃泌素等)[[1]][[3]]
  4. 短期 Y-27632;观察囊状 / 实性生长
  5. 换液 2–3 天;机械传代;怀疑 Barrett 污染时分皿核对形态 / 基因组[[2]]
  6. CK7/CK20、EpCAM、p53(按课题);支原体;与原发灶对照
  7. 药敏设溶媒与标准方案臂;体内成瘤走移植 SOP,不是本页

第 1 步 · 肿瘤处理

  1. 记录 EAC vs ESCC 与 Barrett 邻近情况;分器械。
  2. 胶原酶(MC412)± Dispase(MC413)至小团;血性短时裂红(MC427)。
  3. 勿打成纯单细胞;保留上皮团。

第 2–3 步 · niche 与污染防范

  1. 按亚型选完整 EAC 或 ESCC 配方起步[1][3]。
  2. 怀疑 Barrett 混入时分皿,对照形态与分子特征[2]。
  3. 间质长满时上调 A83-01 或缩短消化。

第 4–5 步 · 质控、冻存与药敏

  1. CK / EpCAM / p53;支原体;与原发灶对照。
  2. 健康库用类器官冻存液(MC415)建库;复苏可加一天 Y-27632。
  3. 药敏设溶媒;体内验证走移植 SOP。

Niche 试剂起点(须滴定)

下表为文献常见起点,不是本站处方浓度。

组分角色站内
Wnt3a + R-spondin + EGF + Noggin ± FGFEAC / 胃肠样核心[1]打开 →
胃泌素(按体系)部分 EAC / Barrett 相关配方打开 →
A83-01 / 烟酰胺抑 TGF-β;人上皮稳定打开 →
胶原酶 II / Dispase活检 / 切除消化打开 →
Y-27632 短期接种窗口打开 →
红细胞裂解液血性消化后短时裂红打开 →
类器官冻存液建库冻存打开 →
Dispase II与胶原酶联用温和解离打开 →

本流程小分子货号

深链到在售货号;价格均为询价。生长因子(EGF/Noggin/R-spondin 等)属蛋白类,见蛋白/酶/多肽分类。

化合物SKU用途价格
Y-27632MCK1042ROCK 抑制;接种/传代后短期提高存活询价
SB202190MCK1279p38 抑制;人上皮类器官稳定询价
A83-01MCK1825ALK4/5/7;减少间质长满询价
RepSoxMCK1826ALK5;TGF-β 抑制备选(对照 A83-01)询价
ThiazovivinMCK1827ROCK;单细胞存活备选(对照 Y-27632)询价
IWP-2MCK1830Porcupine;阻断 Wnt 分泌;CRC Wnt 撤除对照询价
XAV939MCK1831Tankyrase;抑制 Wnt;CRC / 肠对照臂询价
烟酰胺MCK1836人上皮类器官配方常见询价

本流程蛋白 / 多肽货号

生长因子与胃泌素等深链货号;价格均为询价。活性与复溶以批号 COA 为准。

产品SKU用途类型价格
重组人 EGFMGF30001上皮扩增核心生长因子蛋白询价
重组人 NogginMGF30002BMP 拮抗;ENR / PDO niche;双 SMAD 神经诱导常用蛋白询价
重组人 R-spondin-1MGF30003Wnt 放大;长期扩增蛋白询价
重组人 Wnt3aMGF30004人结肠 / CRC 建库 / 导管 / 胃 / 卵巢 / 肝 Wnt蛋白询价
重组人 FGF10MGF30007前列腺 / 胰腺 / 乳腺 / 肺 / 胃 / 卵巢 / 肝 / 内膜 / 肾 niche蛋白询价
人胃泌素 IMGF30009胰腺导管 / 胃 PDO 配方多肽多肽询价

本流程质控抗体货号

建库 / 药敏前 IHC·IF 常用标记;深链现有抗体货号。稀释与种属以说明书为准。

标记产品SKU用途
CK19CK19 抗体MCAB5312导管 / 胆管样上皮;胰与部分肺 / 卵巢 / 膀胱 / 头颈
CK20CK20 抗体MCAB5332结直肠 / 部分胃 / 尿路 / 食管上皮质控
EpCAMEpCAM 抗体MCAB5377广谱上皮;多组织 PDO 通用
E-CadherinE-Cadherin 抗体MCAB1155上皮完整性 / EMT 对照
p53p53 抗体B10301高级别浆液性卵巢癌 / 食管 / 头颈等常见;与原发灶对照
CK7CK7 抗体MCAB5547胆管 / 尿路 / 部分肾小管 / 食管 / 甲状腺 / 间皮上皮质控

本流程培养补充剂货号

B-27 / N-2 / 谷氨酰胺 / 双抗等现有细胞培养货号;浓度按说明书与文献滴定。

产品SKU用途
Advanced DMEM/F12 培养基MC410无血清类器官基底培养基
B-27 补充剂 50×MC317无血清上皮 / 神经类器官基底补充
稳定型谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺,200 mM)MC301Advanced DMEM/F12 体系谷氨酰胺来源
青霉素-链霉素双抗溶液 100×MC306建库早期防污染;稳定后可评估撤除
类器官基底膜基质(BME)MC411dome / sandwich 三维包埋
胶原酶 II 型MC412组织 / 肿瘤消化至上皮小团
Dispase IIMC413与胶原酶联用温和解离
Accutase 温和解离液MC414传代温和酶解备选
类器官冻存液MC415建库冻存
支原体检测试剂盒MC416建库前无菌质控
HEPES 缓冲液(1 M)MC305类器官培养基缓冲;按配方终浓度加入
胶原酶 IV 型MC421解离备选;可与 II 型对照
类器官原代抗菌添加剂(Primocin 类)MC423原代 / PDO / PSC 建库早期防污染
超低吸附 96 孔板MC425EB 形成 / 球体 / 药敏读板
圆底(U 底)96 孔板MC430球体沉降 / 共培养读板;与 ULA 分工
红细胞裂解液MC427血性标本消化后裂红

参考文献

  1. [1] Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nat Commun. 2018. PMID 30061675
  2. [2] Towards personalized induction therapy for esophageal adenocarcinoma: organoids derived from endoscopic biopsy recapitulate the pre-treatment tumor. Sci Rep. 2020. PMID 32884042
  3. [3] Generation and Characterization of Patient-Derived Head and Neck, Oral, and Esophageal Cancer Organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2020. PMID 32294323
免责声明:仅供科研参考(RUO),不构成临床诊疗或实验室法定操作规范。人体组织须取得伦理批件。文内 [n] 对应参考文献。浓度与消化时间必须本地滴定。