细胞培养 / 类器官 / 脑 / 神经类器官

脑 / 神经类器官 protocol（PSC → 大脑类器官提纲）

人多能干细胞衍生大脑类器官提纲：超低吸附孔板形成 EB → 神经诱导（双 SMAD：Noggin/LDN + SB431542，可选）→ 基质胶包埋 → 旋转 / 静置扩增；浓度与窗口按 Lancaster / Chambers 文献滴定。[1][2][3]

适用场景

PSC 衍生脑类器官，不是原代神经元 2D 培养，也不是胶质瘤 PDO。

用途适合度主要读出说明
人 PSC 大脑类器官发育与疾病建模推荐神经上皮、层状结构、疾病表型[1][2]Lancaster 流程可在标准培养室实施；窗口须预实验。
双 SMAD 神经诱导后的 2D 神经祖对照对照PAX6 / SOX2 阳性率[3]2D 对照帮助排查 3D 失败是否来自诱导本身。
原代神经元 2D 或胶质瘤球体冒充脑类器官勿混用贴壁网络 / 球体直径不是 PSC 自组织大脑类器官。

一句话造模

PSC → ULA EB → 神经诱导 ± 双 SMAD → BME 包埋 → Neurobasal/B-27/N-2 扩增 → SOX2/PAX6/MAP2 质控。

流程概览

  1. 确认 PSC / iPSC 干性与支原体合格；伦理与细胞系许可齐全
  2. 超低吸附 96 孔板接种形成 EB；短期 Y-27632
  3. 神经诱导：可按双 SMAD（Noggin 或 LDN193189 + SB431542）或 Lancaster 默认诱导；可选 CHIR / FGF2 窗口[[1]][[3]]
  4. EB 转入基质胶（BME）小滴包埋；转入旋转培养或静置扩增
  5. Neurobasal ± DMEM/F12 + B-27 + N-2 换液；记录批次
  6. 2–4 周起观察脑室样神经上皮；SOX2 / PAX6 / Nestin
  7. 更长期培养评估 MAP2 / βIII-Tubulin；需要区域化时再加模式因子
  8. 疾病建模与药敏在稳定形态后进行；体内移植另页

第 1 步 · EB 形成

  1. TrypLE（MC426）等温和酶将 PSC 单细胞化，计数后接种超低吸附 96 孔板（密度按细胞系滴定）[1]。
  2. 培养基含短期 Y-27632；次日观察 EB 圆整度。
  3. 勿在贴壁培养皿上做 EB——贴壁会破坏 3D 自组织起点。

第 2–3 步 · 神经诱导与包埋

  1. 按所选方案做神经诱导：Lancaster 默认或双 SMAD（Noggin/LDN + SB431542）[1][3]。
  2. 诱导结束后将 EB 包入 BME 小滴，37 °C 凝固后转入扩增培养基。
  3. 需要区域化时再引入 SHH / WNT / FGF 等模式因子，不要一开培就全加上。

第 4–5 步 · 扩增、质控与应用

  1. Neurobasal ± DMEM/F12 + B-27 + N-2 规律换液；旋转培养有助于氧供[1]。
  2. 质控：SOX2 / PAX6 / Nestin（祖）与 MAP2 / βIII-Tubulin（神经元）；支原体。
  3. 药敏或电生理在形态稳定后进行；体内移植另走移植 SOP。

Niche 试剂起点（须滴定）

下表为文献常见起点，不是本站处方浓度。

组分角色站内
超低吸附 96 孔板EB 形成[1]打开 →
Neurobasal + B-27 + N-2神经扩增基底[1]打开 →
Noggin / LDN193189 + SB431542双 SMAD 诱导（可选）[3]打开 →
Activin A / BMP4谱系对照或替代窗口打开 →
CHIR-99021 / FGF2Wnt / FGF 窗口按课题打开 →
基底膜基质（BME）EB 包埋打开 →
Y-27632 短期传代 / EB 窗口打开 →
原代抗菌（Primocin 类）建库早期可选打开 →
TrypLE（PSC 温和解离）单细胞化 / 传代备选打开 →
VEGF-A（血管共培养扩展）默认诱导不加；内皮共培养另立打开 →
胶原酶 II 型组织 / 肿瘤消化至上皮小团打开 →
Dispase II与胶原酶联用温和解离打开 →
类器官冻存液建库冻存打开 →

本流程小分子货号

深链到在售货号；价格均为询价。生长因子（EGF/Noggin/R-spondin 等）属蛋白类，见蛋白/酶/多肽分类。

化合物SKU用途价格
Y-27632MCK1042ROCK 抑制；接种/传代后短期提高存活询价
CHIR-99021MCK1040GSK-3 抑制 → Wnt 激活；干性/谱系诱导询价
SB431542MCK1038ALK4/5/7；双 SMAD / TGF-β 抑制询价
DAPTMCK1021γ-分泌酶 / Notch；分化窗口常用询价
PD0325901MCK1028MEK；PSC 双抑制/谱系转换询价
ThiazovivinMCK1827ROCK；单细胞存活备选（对照 Y-27632）询价
BlebbistatinMCK1828Myosin II；降过度收缩询价
LDN193189MCK1829BMP；双 SMAD / 谱系诱导询价
全反式维甲酸（ATRA）MCK1837肺气道–肺泡定向窗口；默认扩增一般不加询价
按本表询价全部小分子

本流程蛋白 / 多肽货号

生长因子与胃泌素等深链货号；价格均为询价。活性与复溶以批号 COA 为准。

产品SKU用途类型价格
重组人 NogginMGF30002BMP 拮抗；ENR / PDO niche；双 SMAD 神经诱导常用蛋白询价
重组人 FGF2MGF30006前列腺等上皮 niche；脑 / PSC 诱导也常见蛋白询价
重组人 Activin AMGF30011PSC / 脑神经诱导窗口（双 SMAD 对照谱系）蛋白询价
重组人 BMP4MGF30012BMP 轴；谱系诱导 / 与 Noggin·LDN 对照蛋白询价
重组人 VEGF-A（VEGF165）MGF30015血管 / 内皮共培养扩展；默认上皮 PDO 主流程一般不加蛋白询价
按本表询价蛋白 / 酶 / 多肽分类

本流程质控抗体货号

建库 / 药敏前 IHC·IF 常用标记；深链现有抗体货号。稀释与种属以说明书为准。

标记产品SKU用途
SOX2SOX2 抗体MCAB5268神经祖 / 多能干性标记
PAX6PAX6 抗体MCAB5886神经外胚层 / 前脑谱系
NestinNestin 抗体MCAB5655神经祖细胞中间丝；脑 / GBM
MAP2MAP2 抗体MDAB12803成熟神经元树突标记；脑 / GBM 可选
βIII-TubulinβIII-Tubulin 抗体MDAB12328早期神经元骨架
Ki-67Ki-67 抗体B10315增殖指数；药敏前后对照
按本表询价抗体分类

本流程培养补充剂货号

B-27 / N-2 / 谷氨酰胺 / 双抗等现有细胞培养货号；浓度按说明书与文献滴定。

产品SKU用途
Advanced DMEM/F12 培养基MC410无血清类器官基底培养基
B-27 补充剂 50×MC317无血清上皮 / 神经类器官基底补充
N-2 补充剂 100×MC318神经 / 部分上皮配方常用；与 B-27 按体系选用
稳定型谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，200 mM）MC301Advanced DMEM/F12 体系谷氨酰胺来源
青霉素-链霉素双抗溶液 100×MC306建库早期防污染；稳定后可评估撤除
类器官基底膜基质（BME）MC411dome / sandwich 三维包埋
胶原酶 II 型MC412组织 / 肿瘤消化至上皮小团
Dispase IIMC413与胶原酶联用温和解离
Accutase 温和解离液MC414传代温和酶解备选
类器官冻存液MC415建库冻存
支原体检测试剂盒MC416建库前无菌质控
HEPES 缓冲液（1 M）MC305类器官培养基缓冲；按配方终浓度加入
胶原酶 IV 型MC421解离备选；可与 II 型对照
类器官原代抗菌添加剂（Primocin 类）MC423原代 / PDO / PSC 建库早期防污染
Neurobasal 培养基MC424脑 / 神经 / GBM 类器官基底
超低吸附 96 孔板MC425EB 形成 / 球体 / 药敏读板
圆底（U 底）96 孔板MC430球体沉降 / 共培养读板；与 ULA 分工
TrypLE 温和解离液MC426PSC / 类器官温和传代备选
按本表询价培养补充剂分类

参考文献

  1. [1] Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014. PMID 25188634
  2. [2] Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013. PMID 23995685
  3. [3] Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 2009. PMID 19252478

相关入口

其他分步 SOP

免责声明：仅供科研参考（RUO），不构成临床诊疗或实验室法定操作规范。人体组织须取得伦理批件。文内 [n] 对应参考文献。浓度与消化时间必须本地滴定。