细胞培养 / 类器官 / 前列腺癌 PDO

前列腺癌 PDO 建库 protocol

患者来源前列腺癌类器官（PDO）的傻瓜式体外流程：组织消化 → 基质胶 dome → 含 DHT 的 niche 培养基 → 传代/冻存与 AR 质控。浓度须按 Gao / Drost 文献与预实验滴定，不替代产品说明书。[1][2]

适用场景

本页只做体外 PDO。细胞株球体与体内 CDX 见对照行，勿把步骤混用。

用途适合度主要读出说明
患者来源前列腺癌 PDO推荐腺腔形态、AR/CK、±DHT 生长与药敏[1][2]本页核心：活检/根治标本包埋建库。AR+ 腺癌默认加 DHT；NEPC/双阴勿照搬。
LNCaP / 22Rv1 三维球体对照球体直径、活力；可作 AR+ 药敏对照细胞株 3D 不是 PDO。培养基与传代按说明书，勿套本页组织消化。
LNCaP 皮下/原位移植勿混用瘤体积、血清 PSA体内 CDX 另有移植傻瓜流程；Matrigel 栓 ≠ 类器官 dome。

一句话造模

新鲜前列腺肿瘤小团 → 基质胶 dome → DHT + Wnt/Noggin/EGF + A83-01 → 短期 Y-27632 → 机械传代 → AR/支原体后建库。

流程概览

  1. 伦理批件 + 冷链取材（手术/穿刺肿瘤，当天接种）
  2. 剔除脂肪与坏死；PBS 洗；剪成 ~1 mm³
  3. 胶原酶 ± Dispase 消化至小团（勿打成纯单细胞）
  4. 过筛、离心；基质胶冰上混合，点 dome，37 °C 凝固
  5. 加入含 DHT 的前列腺 niche 培养基 + 短期 Y-27632
  6. 每 2–3 天换液；7–14 天按生长传代（优先机械微簇）
  7. 形态 + AR/CK ± PSA/PSMA；支原体后再建库冻存
  8. 药敏：±DHT、AR 拮抗剂；体内成瘤另走移植 SOP

第 1 步 · 取材与消化

  1. 伦理批件齐全；标本 4 °C 转运，尽量当天接种。
  2. 冰上剔除脂肪与明显坏死，PBS 洗去血。
  3. 剪成 ~1 mm³；胶原酶 ± Dispase 37 °C 消化 30–90 min，至可见小团而非纯单细胞[2]。
  4. 70–100 μm 过筛，低速离心；红细胞多时短时裂红（MC427）。

第 2 步 · 基质胶包埋（dome）

  1. 预冷枪头与孔板；基质保持液体，避免反复冻融。
  2. 冰上混合细胞小团与基质，24 孔约 20–40 μL/dome。
  3. 37 °C 凝固至不流动后，沿壁加预热完全培养基，勿冲散胶滴[2]。

第 3 步 · 含 DHT 的 niche 培养

  1. AR+ 腺癌：基底 + B-27 + DHT + EGF/Noggin/R-spondin + A83-01 等（见试剂表；浓度按[1][2]滴定）。默认无血清，一般不需要活性炭处理 FBS。
  2. 接种后加 Y-27632，存活稳定后撤药，勿全程留 ROCK 抑制剂。
  3. 前几天可半量换液，之后每 2–3 天换液；观察腺腔形成。
  4. NEPC 或 AR− 表型不要默认加 DHT。需用含血清配方或严格去雄/加回时，见下方「charcoal-stripped FBS」专节。

第 4 步 · 传代

  1. 直径过大、中心坏死或培养基迅速酸化时传代（多 7–14 天）。
  2. 冰上或温和酶化开基质；优先机械吹打成微簇[2]。
  3. 仅当需要单细胞时短时 TrypLE（MC426）等温和酶解。按 1:2–1:4 重新包埋；首 24 h 可再加 Y-27632。

第 5 步 · 冻存、质控与药敏

  1. 生长良好、无污染者去胶或保留微滴，类器官相容冻存液，程序降温后液氮。
  2. 建库前：形态照片、代数、支原体；AR+ 预期 CK8/18、AR、±PSA/PSMA[1][3]。
  3. 药敏设 ±DHT 与 AR 拮抗剂对照（无血清体系直接撤/加 DHT 即可）。体内成瘤走 LNCaP 等移植协议，不是本 SOP。

Niche 试剂起点（须滴定）

下表为文献常见起点，不是本站处方浓度。

组分角色站内
Advanced DMEM/F12 + B-27 + GlutaMAX / L-Gln + 双抗基底与无血清补充打开 →
DHT 1–10 nMAR+ 前列腺关键雄激素[1][2]打开 →
EGF / Noggin / R-spondin上皮增殖与 Wnt 放大[2][3]打开 →
A83-01抑 TGF-β，减少间质长满[2]打开 →
FGF2 / FGF10、烟酰胺、NAC（Drost 体系）按文献滴定，不作处方[2]打开 →
Y-27632 ~10 μM仅接种/传代后约 2–7 天[2]打开 →
Charcoal-stripped FBS（CSS）默认建库不用；仅含血清+激素操纵场景，见专节打开 →
KSFM（替代无血清基底）仅 CSS+KSFM 替代配方，见专节打开 →
TrypLE（温和酶解备选）需单细胞时短时；优先机械吹打打开 →
胶原酶 II 型组织 / 肿瘤消化至上皮小团打开 →
Dispase II与胶原酶联用温和解离打开 →
类器官冻存液建库冻存打开 →

何时需要 charcoal-stripped FBS（活性炭处理血清）

本页默认建库走 Drost/Gao 无血清路线（B-27 + 外源 DHT），一般不购、不加活性炭处理血清。仅在下列「含血清 + 激素操纵」场景才换用 charcoal-stripped FBS（CSS），把内源甾体剥掉后再加回定义浓度的 DHT。

场景需要 CSS？方案
PDO 建库 / 常规扩增（本页主流程）不需要Advanced DMEM/F12 + B-27 + niche 因子 + DHT；不加普通 FBS，也不加 CSS[2]。
无血清体系下的 ±DHT / AR 拮抗剂药敏不需要直接「撤 DHT vs 加 DHT（1–10 nM）」；固定 B-27 批号。CSS 不能替代明确的 ±DHT 臂。
改用含 FBS 的扩增或药敏配方需要先换成 CSS（常用 5% 量级，按文献滴定），饥饿 24–72 h 后加回 DHT；勿用未处理 FBS 做去雄结论。
KSFM 等「无血清基底 + 少量血清」替代类器官配方需要基底用 KSFM（MC428）或同类，补 CSS（MC419）+ DHT（文献常见约 10 nM）；与 B-27 主流程分皿，勿混批。
LNCaP / 22Rv1 二维或球体雄激素响应（对照，非 PDO）需要RPMI 等 + CSS，去雄后加 DHT/拮抗剂；按细胞株说明书，不套本页组织消化。
普通 FBS 维持培养、支原体筛查、非激素读出不需要可用常规 FBS；激素相关结论仍须回到 B-27±DHT 或 CSS±DHT 体系。
  • ·CSS = charcoal-stripped FBS：活性炭吸附去除血清中甾体等小分子，批间仍有差异，记录货号与批号。
  • ·加回 DHT 时用乙醇/DMSO 储液，终溶剂浓度与溶媒对照一致；典型工作浓度仍按 1–10 nM 滴定。
  • ·不要在 B-27 完全培养基上再叠一层普通 FBS「保险」——会引入未控甾体，抵消定义 DHT 的意义。
  • ·询价时可注明货号 MC419（活性炭处理 FBS / CSS）；与常规 FBS 专页产品区分。

本流程小分子货号

深链到在售货号；价格均为询价。生长因子（EGF/Noggin/R-spondin 等）属蛋白类，见蛋白/酶/多肽分类。

化合物SKU用途价格
Y-27632MCK1042ROCK 抑制；接种/传代后短期提高存活询价
SB431542MCK1038ALK4/5/7；双 SMAD / TGF-β 抑制询价
SB202190MCK1279p38 抑制；人上皮类器官稳定询价
A83-01MCK1825ALK4/5/7；减少间质长满询价
RepSoxMCK1826ALK5；TGF-β 抑制备选（对照 A83-01）询价
ThiazovivinMCK1827ROCK；单细胞存活备选（对照 Y-27632）询价
PGE2MCK1833前列腺类器官配方常见询价
DHTMCK1834AR+ 前列腺类器官关键雄激素询价
烟酰胺MCK1836人上皮类器官配方常见询价
按本表询价全部小分子

本流程蛋白 / 多肽货号

生长因子与胃泌素等深链货号；价格均为询价。活性与复溶以批号 COA 为准。

产品SKU用途类型价格
重组人 EGFMGF30001上皮扩增核心生长因子蛋白询价
重组人 NogginMGF30002BMP 拮抗；ENR / PDO niche；双 SMAD 神经诱导常用蛋白询价
重组人 R-spondin-1MGF30003Wnt 放大；长期扩增蛋白询价
重组人 FGF2MGF30006前列腺等上皮 niche；脑 / PSC 诱导也常见蛋白询价
重组人 FGF10MGF30007前列腺 / 胰腺 / 乳腺 / 肺 / 胃 / 卵巢 / 肝 / 内膜 / 肾 niche蛋白询价
重组人 IGF-1MGF30013部分上皮 / 乳腺 / 肝配方可见蛋白询价
按本表询价蛋白 / 酶 / 多肽分类

本流程质控抗体货号

建库 / 药敏前 IHC·IF 常用标记；深链现有抗体货号。稀释与种属以说明书为准。

标记产品SKU用途
AR雄激素受体 (AR) 抗体MCAB5030前列腺 PDO 上皮 / AR 通路质控
PSAPSA / KLK3 抗体MCAB5775前列腺分泌表型辅助质控
PSMAPSMA 抗体MCAB5192前列腺上皮标记（按课题选用）
CK8CK8 抗体MCAB5383腔面 / 上皮谱系
CK18CK18 抗体MCAB5028腔面上皮；乳腺/前列腺/卵巢/内膜常用
EpCAMEpCAM 抗体MCAB5377广谱上皮；多组织 PDO 通用
Ki-67Ki-67 抗体B10315增殖指数；药敏前后对照
按本表询价抗体分类

本流程培养补充剂货号

B-27 / N-2 / 谷氨酰胺 / 双抗等现有细胞培养货号；浓度按说明书与文献滴定。

产品SKU用途
Advanced DMEM/F12 培养基MC410无血清类器官基底培养基
B-27 补充剂 50×MC317无血清上皮 / 神经类器官基底补充
稳定型谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，200 mM）MC301Advanced DMEM/F12 体系谷氨酰胺来源
青霉素-链霉素双抗溶液 100×MC306建库早期防污染；稳定后可评估撤除
ITS 补充剂 100×MC311胰岛素-转铁蛋白-硒；部分上皮配方
类器官基底膜基质（BME）MC411dome / sandwich 三维包埋
胶原酶 II 型MC412组织 / 肿瘤消化至上皮小团
Dispase IIMC413与胶原酶联用温和解离
Accutase 温和解离液MC414传代温和酶解备选
类器官冻存液MC415建库冻存
支原体检测试剂盒MC416建库前无菌质控
N-乙酰半胱氨酸（NAC）MC417前列腺等上皮配方抗氧化组分
活性炭处理胎牛血清（CSS）MC419含血清激素操纵场景；默认无血清建库一般不用
HEPES 缓冲液（1 M）MC305类器官培养基缓冲；按配方终浓度加入
胶原酶 IV 型MC421解离备选；可与 II 型对照
类器官原代抗菌添加剂（Primocin 类）MC423原代 / PDO / PSC 建库早期防污染
超低吸附 96 孔板MC425EB 形成 / 球体 / 药敏读板
圆底（U 底）96 孔板MC430球体沉降 / 共培养读板；与 ULA 分工
TrypLE 温和解离液MC426PSC / 类器官温和传代备选
红细胞裂解液MC427血性标本消化后裂红
角质形成细胞无血清培养基（KSFM）MC428前列腺 CSS 场景；皮肤 / 表皮配方可对照
按本表询价培养补充剂分类

参考文献

  1. [1] Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 2014. PMID 25201530
  2. [2] Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 2016. PMID 27010729
  3. [3] Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 2014. PMID 24905166

相关入口

其他分步 SOP

免责声明：仅供科研参考（RUO），不构成临床诊疗或实验室法定操作规范。人体组织须取得伦理批件。文内 [n] 对应参考文献。浓度与消化时间必须本地滴定。