细胞培养 / 类器官 / 胃癌 PDO

胃癌 PDO 建库 protocol

患者来源胃癌类器官:消化包埋后用胃上皮 niche(Wnt / R-spondin / Noggin / EGF / FGF10 / 胃泌素)建库,再按亚型做 CK20 / EpCAM 质控与药敏。[1][2][3]

适用场景

胃癌 PDO,不是正常胃腺体扩增全程,也不是 AGS 球体。

用途适合度主要读出说明
胃癌手术 / 转移灶 PDO 活库推荐亚型保持、药敏[1][3]Yan 活库显示器官样培养可保留异质性。
正常胃腺体类器官对照对照毒性对照[2]正常胃配方接近但勿与肿瘤药敏皿混用。
AGS / MKN 球体勿混用球体直径细胞株球体不是患者 PDO。

一句话造模

胃肿瘤小团 → dome → Wnt/FGF10/胃泌素 niche → 短期 Y-27632 → 机械传代 → CK/EpCAM → 药敏。

流程概览

  1. 伦理 + 冷链;记录 Lauren / WHO 分型与幽门螺杆菌史(若有)
  2. 剔除坏死;胶原酶消化至小团;与正常胃黏膜分皿
  3. 基质胶 dome;胃 niche(Wnt3a、R-spondin、Noggin、EGF、FGF10、胃泌素)[[1]][[2]]
  4. 短期 Y-27632 + A83-01;观察囊状出芽
  5. 换液 2–3 天;按生长机械传代
  6. CK19/20、EpCAM、E-Cadherin;支原体;与原发灶对照
  7. 药敏设溶媒与标准方案臂(按课题)[[3]]
  8. 体内验证走移植 SOP

第 1 步 · 肿瘤处理

  1. 与正常切缘分器械;粘液丰富标本可适当延长洗涤。
  2. 胶原酶至小团;过筛离心;红细胞多时短时裂红(MC427)。
  3. 弥漫型可更碎,但勿打成纯单细胞。

第 2–3 步 · 胃 niche

  1. 建库用完整 Wnt/FGF10/胃泌素配方[1][2]。
  2. 生长稳定后按课题评估是否下调 Wnt;不要为省试剂过早撤。
  3. 记录 Lauren 分型与药敏板对应关系。

第 4–5 步 · 质控与药敏

  1. 机械传代;建库前 CK / EpCAM / E-Cadherin。
  2. 药敏设溶媒与临床相关方案臂[3]。
  3. 体内成瘤另走移植协议。

Niche 试剂起点(须滴定)

下表为文献常见起点,不是本站处方浓度。

组分角色站内
Wnt3a + R-spondin + EGF + FGF10 + Noggin胃上皮核心[1][2]打开 →
胃泌素 I人胃体系常见打开 →
A83-01抑 TGF-β / 间质打开 →
Y-27632 短期接种窗口打开 →
红细胞裂解液血性消化后短时裂红打开 →
胶原酶 II 型组织 / 肿瘤消化至上皮小团打开 →
Dispase II与胶原酶联用温和解离打开 →
类器官冻存液建库冻存打开 →

本流程小分子货号

深链到在售货号;价格均为询价。生长因子(EGF/Noggin/R-spondin 等)属蛋白类,见蛋白/酶/多肽分类。

化合物SKU用途价格
Y-27632MCK1042ROCK 抑制;接种/传代后短期提高存活询价
SB202190MCK1279p38 抑制;人上皮类器官稳定询价
A83-01MCK1825ALK4/5/7;减少间质长满询价
烟酰胺MCK1836人上皮类器官配方常见询价

本流程蛋白 / 多肽货号

生长因子与胃泌素等深链货号;价格均为询价。活性与复溶以批号 COA 为准。

产品SKU用途类型价格
重组人 EGFMGF30001上皮扩增核心生长因子蛋白询价
重组人 NogginMGF30002BMP 拮抗;ENR / PDO niche;双 SMAD 神经诱导常用蛋白询价
重组人 R-spondin-1MGF30003Wnt 放大;长期扩增蛋白询价
重组人 Wnt3aMGF30004人结肠 / CRC 建库 / 导管 / 胃 / 卵巢 / 肝 Wnt蛋白询价
重组人 FGF10MGF30007前列腺 / 胰腺 / 乳腺 / 肺 / 胃 / 卵巢 / 肝 / 内膜 / 肾 niche蛋白询价
人胃泌素 IMGF30009胰腺导管 / 胃 PDO 配方多肽多肽询价

本流程质控抗体货号

建库 / 药敏前 IHC·IF 常用标记;深链现有抗体货号。稀释与种属以说明书为准。

标记产品SKU用途
CK19CK19 抗体MCAB5312导管 / 胆管样上皮;胰与部分肺 / 卵巢 / 膀胱 / 头颈
CK20CK20 抗体MCAB5332结直肠 / 部分胃 / 尿路 / 食管上皮质控
EpCAMEpCAM 抗体MCAB5377广谱上皮;多组织 PDO 通用
E-CadherinE-Cadherin 抗体MCAB1155上皮完整性 / EMT 对照
Ki-67Ki-67 抗体B10315增殖指数;药敏前后对照

本流程培养补充剂货号

B-27 / N-2 / 谷氨酰胺 / 双抗等现有细胞培养货号;浓度按说明书与文献滴定。

产品SKU用途
Advanced DMEM/F12 培养基MC410无血清类器官基底培养基
B-27 补充剂 50×MC317无血清上皮 / 神经类器官基底补充
稳定型谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺,200 mM)MC301Advanced DMEM/F12 体系谷氨酰胺来源
青霉素-链霉素双抗溶液 100×MC306建库早期防污染;稳定后可评估撤除
类器官基底膜基质(BME)MC411dome / sandwich 三维包埋
胶原酶 II 型MC412组织 / 肿瘤消化至上皮小团
Dispase IIMC413与胶原酶联用温和解离
Accutase 温和解离液MC414传代温和酶解备选
类器官冻存液MC415建库冻存
支原体检测试剂盒MC416建库前无菌质控
HEPES 缓冲液(1 M)MC305类器官培养基缓冲;按配方终浓度加入
胶原酶 IV 型MC421解离备选;可与 II 型对照
类器官原代抗菌添加剂(Primocin 类)MC423原代 / PDO / PSC 建库早期防污染
超低吸附 96 孔板MC425EB 形成 / 球体 / 药敏读板
圆底(U 底)96 孔板MC430球体沉降 / 共培养读板;与 ULA 分工
红细胞裂解液MC427血性标本消化后裂红

参考文献

  1. [1] A Living Biobank of Patient-Derived Gastric Cancer Organoids. Cell Stem Cell. 2018. PMID 30343896
  2. [2] In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 2015. PMID 25768904
  3. [3] Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 2018. PMID 29420295
免责声明:仅供科研参考(RUO),不构成临床诊疗或实验室法定操作规范。人体组织须取得伦理批件。文内 [n] 对应参考文献。浓度与消化时间必须本地滴定。