细胞培养 / 类器官 / 胰腺癌 PDO

胰腺癌 PDO 建库 protocol

胰腺导管腺癌类器官:间质丰富,需充分消化后包埋,用 Wnt / R-spondin / EGF / FGF10 / Noggin 等导管 niche 建库,再按 Wnt 依赖分型。[1][2][3]

适用场景

PDAC PDO,不是胰岛类器官,也不是成体胰腺导管的非肿瘤扩增(可对照但不混皿)。

用途适合度主要读出说明
PDAC 患者 PDO 药敏推荐活力与化疗响应[3]Tiriac 等显示类器官可分层常见化疗响应。
正常胰腺导管类器官对照囊状扩增[1]Wnt 依赖通常更高;与肿瘤分皿。
胰岛 / β 细胞分化勿混用胰岛素分泌内分泌定向是另一套 PSC/成体配方。

一句话造模

PDAC 标本去间质消化 → dome → Wnt/FGF10 导管培养基 → 按 Seino 分型撤 Wnt → CK19 + 支原体 → 化疗药敏。

流程概览

  1. 伦理 + 冷链;EUS/手术标本尽快处理
  2. 胰腺肿瘤间质多:延长胶原酶,仍保留上皮小团[[1]]
  3. dome;导管配方含 Wnt3a、R-spondin、EGF、FGF10、Noggin、胃泌素等[[1]][[2]]
  4. 短期 Y-27632;A83-01 限制 TGF-β 纤维化细胞
  5. 稳定后按 Wnt 依赖分型:有的株可撤 Wnt[[2]]
  6. 囊状/出芽形态 + CK19;支原体
  7. 吉西他滨/FOLFIRINOX 等药敏按课题[[3]]
  8. 内分泌胰岛诱导不是本 SOP

第 1 步 · 去间质消化

  1. PDAC 纤维多,酶切时间常长于肠/前列腺,但仍以上皮团而非单细胞为目标[1]。
  2. 红细胞与碎片离心去除;血性标本短时裂红(MC427);必要时短暂贴壁丢成纤维(勿丢上皮团)。

第 2–3 步 · 导管 niche 与 Wnt 分型

  1. 建库用完整 Wnt/FGF10 配方[1]。
  2. Seino 分型:部分肿瘤进展后丢失 niche 因子依赖,可尝试撤 Wnt[2]。
  3. 生长停滞时先回调 Wnt,不要当成污染丢掉。

第 4–5 步 · 质控与药敏

  1. CK19 导管表型;排除广泛胰岛激素阳性(除非课题就是混合)。
  2. 药敏在稳定传代后做,记录基质批次[3]。

Niche 试剂起点(须滴定)

下表为文献常见起点,不是本站处方浓度。

组分角色站内
Wnt3a + R-spondin + EGF + FGF10 + Noggin导管核心[1]打开 →
胃泌素、烟酰胺、PGE2(按文献)人胰腺体系常见[2]打开 →
A83-01抑 TGF-β / 间质[2]打开 →
Y-27632 短期接种存活打开 →
红细胞裂解液血性消化后短时裂红打开 →
胶原酶 II 型组织 / 肿瘤消化至上皮小团打开 →
Dispase II与胶原酶联用温和解离打开 →
类器官冻存液建库冻存打开 →

本流程小分子货号

深链到在售货号;价格均为询价。生长因子(EGF/Noggin/R-spondin 等)属蛋白类,见蛋白/酶/多肽分类。

化合物SKU用途价格
Y-27632MCK1042ROCK 抑制;接种/传代后短期提高存活询价
A83-01MCK1825ALK4/5/7;减少间质长满询价
烟酰胺MCK1836人上皮类器官配方常见询价

本流程蛋白 / 多肽货号

生长因子与胃泌素等深链货号;价格均为询价。活性与复溶以批号 COA 为准。

产品SKU用途类型价格
重组人 EGFMGF30001上皮扩增核心生长因子蛋白询价
重组人 NogginMGF30002BMP 拮抗;ENR / PDO niche;双 SMAD 神经诱导常用蛋白询价
重组人 R-spondin-1MGF30003Wnt 放大;长期扩增蛋白询价
重组人 Wnt3aMGF30004人结肠 / CRC 建库 / 导管 / 胃 / 卵巢 / 肝 Wnt蛋白询价
重组人 FGF10MGF30007前列腺 / 胰腺 / 乳腺 / 肺 / 胃 / 卵巢 / 肝 / 内膜 / 肾 niche蛋白询价
人胃泌素 IMGF30009胰腺导管 / 胃 PDO 配方多肽多肽询价

本流程质控抗体货号

建库 / 药敏前 IHC·IF 常用标记;深链现有抗体货号。稀释与种属以说明书为准。

标记产品SKU用途
CK19CK19 抗体MCAB5312导管 / 胆管样上皮;胰与部分肺 / 卵巢 / 膀胱 / 头颈
EpCAMEpCAM 抗体MCAB5377广谱上皮;多组织 PDO 通用
Ki-67Ki-67 抗体B10315增殖指数;药敏前后对照

本流程培养补充剂货号

B-27 / N-2 / 谷氨酰胺 / 双抗等现有细胞培养货号;浓度按说明书与文献滴定。

产品SKU用途
Advanced DMEM/F12 培养基MC410无血清类器官基底培养基
B-27 补充剂 50×MC317无血清上皮 / 神经类器官基底补充
稳定型谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺,200 mM)MC301Advanced DMEM/F12 体系谷氨酰胺来源
青霉素-链霉素双抗溶液 100×MC306建库早期防污染;稳定后可评估撤除
类器官基底膜基质(BME)MC411dome / sandwich 三维包埋
胶原酶 II 型MC412组织 / 肿瘤消化至上皮小团
Dispase IIMC413与胶原酶联用温和解离
Accutase 温和解离液MC414传代温和酶解备选
类器官冻存液MC415建库冻存
支原体检测试剂盒MC416建库前无菌质控
HEPES 缓冲液(1 M)MC305类器官培养基缓冲;按配方终浓度加入
胶原酶 IV 型MC421解离备选;可与 II 型对照
类器官原代抗菌添加剂(Primocin 类)MC423原代 / PDO / PSC 建库早期防污染
超低吸附 96 孔板MC425EB 形成 / 球体 / 药敏读板
圆底(U 底)96 孔板MC430球体沉降 / 共培养读板;与 ULA 分工
红细胞裂解液MC427血性标本消化后裂红

参考文献

  1. [1] Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 2015. PMID 25557080
  2. [2] Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression. Cell Stem Cell. 2018. PMID 29249464
  3. [3] Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discov. 2018. PMID 29853643
免责声明:仅供科研参考(RUO),不构成临床诊疗或实验室法定操作规范。人体组织须取得伦理批件。文内 [n] 对应参考文献。浓度与消化时间必须本地滴定。