细胞培养 / 类器官 / 肝类器官

人肝胆管类器官建库 protocol

成体人肝胆管来源双能祖细胞类器官：消化包埋后用 Huch 型培养基（R-spondin / EGF / FGF10 / HGF + 烟酰胺 / A83-01 / Forskolin 等）长期扩增，可再诱导肝细胞样分化。[1][2]

适用场景

胆管扩增类器官，不是原代肝细胞长期 2D 培养，也不是 HCC 细胞株球体。

用途适合度主要读出说明
成体肝胆管类器官扩增与疾病建模推荐扩增、基因组稳定、可分化[1]Huch 体系支持长期扩增与部分遗传疾病镜像。
毒性 / 代谢预实验（分化后）对照白蛋白、CYP 等功能读出扩增态不作成熟肝细胞替代。
HepG2 球体当作肝类器官勿混用球体直径细胞株球体不是成体胆管类器官。

一句话造模

肝组织胆管富集 → dome → Rspo/EGF/FGF10/HGF niche → 短期 Y-27632 → 机械传代 → CK19/EpCAM → 可选肝细胞分化。

流程概览

  1. 伦理 + 冷链；手术肝组织或活检
  2. 剔除脂肪与明显坏死；胶原酶 ± Dispase 消化，富集胆管上皮
  3. 基质胶 dome；Huch 型培养基（Rspo、EGF、FGF10、HGF、烟酰胺、A83-01、Forskolin 等）[[1]]
  4. 短期 Y-27632；观察囊状胆管样生长
  5. 换液 2–3 天；按生长机械传代
  6. CK19 / CK7 / EpCAM；支原体；扩增期白蛋白通常低
  7. 需要肝细胞功能时再切分化条件（撤扩增因子、加分化配方）[[1]]
  8. 体内移植另走移植 SOP

第 1 步 · 组织消化

  1. 记录取材部位（外周肝实质优先富集胆管）。
  2. 胶原酶 ± Dispase 至小团；过筛离心。
  3. 红细胞多时用裂解液短时裂红（MC427）；勿追求纯单细胞。

第 2–3 步 · 扩增 niche

  1. 完整 Huch 型配方起步[1]。
  2. 囊状结构出现后机械传代；记录代数与基质批次。
  3. 污染或支原体阳性立即隔离。

第 4–5 步 · 质控与分化

  1. 扩增期：CK19 / CK7 / EpCAM；白蛋白通常不高。
  2. 分化期：撤扩增关键因子，按文献加 OSM、地塞米松等；与扩增分皿（见专节）。
  3. 体内验证走移植模型，不是本页。

Niche 试剂起点（须滴定）

下表为文献常见起点，不是本站处方浓度。

组分角色站内
Advanced DMEM/F12 + B-27基底打开 →
R-spondin + EGF + FGF10 + HGFHuch 核心[1]打开 →
烟酰胺 / A83-01 / Forskolin人肝扩增常见打开 →
基底膜基质（BME）dome 包埋打开 →
Y-27632 短期接种窗口打开 →
红细胞裂解液血性消化后裂红打开 →
TrypLE（温和传代备选）需单细胞时短时；扩增优先机械打开 →
OSM（分化期）肝细胞样分化关键之一打开 →
地塞米松（分化期）与 OSM 等联用；扩增期不加打开 →
VEGF-A（血管共培养扩展）默认扩增/分化不加；内皮共培养另立打开 →
胶原酶 II 型组织 / 肿瘤消化至上皮小团打开 →
Dispase II与胶原酶联用温和解离打开 →
类器官冻存液建库冻存打开 →

扩增 vs 肝细胞样分化（分册）

本页默认是胆管样扩增。需要白蛋白 / CYP 等肝细胞功能时，另开分化皿：撤 Rspo/EGF/FGF10/HGF 等扩增关键，再按文献加入 OSM、地塞米松等。勿在同一皿「边扩增边分化」。

场景需要 CSS？方案
长期扩增、建库、基因组操作不需要Huch 扩增配方；不加 OSM / Dex 作维持。
肝细胞样功能 / 毒性预实验需要分化皿：OSM（MGF30014）+ 地塞米松（MC429）等按文献滴定；读白蛋白抗体等。
仍要扩增又要功能读出需要分皿：一皿扩增保种，一皿切入分化；不要混培养基。
  • ·「needCss」列在此专节表示「是否需要切分化配方」，不是血清 CSS。
  • ·分化窗口批间差异大，记录 OSM / Dex 批号与天数。
  • ·扩增期白蛋白低不代表建库失败。

本流程小分子货号

深链到在售货号；价格均为询价。生长因子（EGF/Noggin/R-spondin 等）属蛋白类，见蛋白/酶/多肽分类。

化合物SKU用途价格
Y-27632MCK1042ROCK 抑制；接种/传代后短期提高存活询价
A83-01MCK1825ALK4/5/7；减少间质长满询价
ForskolinMCK1832腺苷酸环化酶；cAMP；卵巢等配方常见询价
烟酰胺MCK1836人上皮类器官配方常见询价
按本表询价全部小分子

本流程蛋白 / 多肽货号

生长因子与胃泌素等深链货号；价格均为询价。活性与复溶以批号 COA 为准。

产品SKU用途类型价格
重组人 EGFMGF30001上皮扩增核心生长因子蛋白询价
重组人 NogginMGF30002BMP 拮抗；ENR / PDO niche；双 SMAD 神经诱导常用蛋白询价
重组人 R-spondin-1MGF30003Wnt 放大；长期扩增蛋白询价
重组人 Wnt3aMGF30004人结肠 / CRC 建库 / 导管 / 胃 / 卵巢 / 肝 Wnt蛋白询价
重组人 FGF10MGF30007前列腺 / 胰腺 / 乳腺 / 肺 / 胃 / 卵巢 / 肝 / 内膜 / 肾 niche蛋白询价
重组人 HGFMGF30010人肝胆管类器官关键蛋白询价
重组人 IGF-1MGF30013部分上皮 / 乳腺 / 肝配方可见蛋白询价
重组人 Oncostatin M（OSM）MGF30014肝类器官肝细胞样分化关键之一蛋白询价
重组人 VEGF-A（VEGF165）MGF30015血管 / 内皮共培养扩展；默认上皮 PDO 主流程一般不加蛋白询价
按本表询价蛋白 / 酶 / 多肽分类

本流程质控抗体货号

建库 / 药敏前 IHC·IF 常用标记；深链现有抗体货号。稀释与种属以说明书为准。

标记产品SKU用途
CK19CK19 抗体MCAB5312导管 / 胆管样上皮；胰与部分肺 / 卵巢 / 膀胱 / 头颈
EpCAMEpCAM 抗体MCAB5377广谱上皮；多组织 PDO 通用
CK7CK7 抗体MCAB5547胆管 / 尿路 / 部分肾小管 / 食管 / 甲状腺 / 间皮上皮质控
Albumin白蛋白抗体MDAB15418肝细胞样分化读出（扩增期通常低）
Ki-67Ki-67 抗体B10315增殖指数；药敏前后对照
按本表询价抗体分类

本流程培养补充剂货号

B-27 / N-2 / 谷氨酰胺 / 双抗等现有细胞培养货号；浓度按说明书与文献滴定。

产品SKU用途
Advanced DMEM/F12 培养基MC410无血清类器官基底培养基
B-27 补充剂 50×MC317无血清上皮 / 神经类器官基底补充
N-2 补充剂 100×MC318神经 / 部分上皮配方常用；与 B-27 按体系选用
稳定型谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，200 mM）MC301Advanced DMEM/F12 体系谷氨酰胺来源
青霉素-链霉素双抗溶液 100×MC306建库早期防污染；稳定后可评估撤除
ITS 补充剂 100×MC311胰岛素-转铁蛋白-硒；部分上皮配方
类器官基底膜基质（BME）MC411dome / sandwich 三维包埋
胶原酶 II 型MC412组织 / 肿瘤消化至上皮小团
Dispase IIMC413与胶原酶联用温和解离
Accutase 温和解离液MC414传代温和酶解备选
类器官冻存液MC415建库冻存
支原体检测试剂盒MC416建库前无菌质控
HEPES 缓冲液（1 M）MC305类器官培养基缓冲；按配方终浓度加入
胶原酶 IV 型MC421解离备选；可与 II 型对照
类器官原代抗菌添加剂（Primocin 类）MC423原代 / PDO / PSC 建库早期防污染
超低吸附 96 孔板MC425EB 形成 / 球体 / 药敏读板
圆底（U 底）96 孔板MC430球体沉降 / 共培养读板；与 ULA 分工
TrypLE 温和解离液MC426PSC / 类器官温和传代备选
红细胞裂解液MC427血性标本消化后裂红
地塞米松MC429肝细胞样分化糖皮质激素
按本表询价培养补充剂分类

参考文献

  1. [1] Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 2015. PMID 25533785
  2. [2] In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 2013. PMID 24332895
  3. [3] Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2017. PMID 28218919

相关入口

其他分步 SOP

免责声明：仅供科研参考（RUO），不构成临床诊疗或实验室法定操作规范。人体组织须取得伦理批件。文内 [n] 对应参考文献。浓度与消化时间必须本地滴定。