细胞培养 / 类器官 / 胰腺神经内分泌瘤 PDO

胰腺 / GEP 神经内分泌瘤 PDO 建库 protocol

患者来源胰腺神经内分泌瘤(pNET)及 GEP-NET / NEC 类器官:消化包埋后用神经内分泌–上皮 niche(EGF / FGF2 ± R-spondin / Wnt、短期 Y-27632)建库,与 PDAC 导管配方分皿,做 CgA / Synaptophysin 质控与靶向 / GSK3 等药敏对照。[1][2]

适用场景

pNET / GEP-NET PDO,不是 PDAC 导管类器官,也不是胰岛功能扩增课程。

用途适合度主要读出说明
pNET / GEP-NET PDO 活库与靶向药敏推荐神经内分泌标记保持、药敏[1][2]GSK3 抑制等组合在 pNET 三维模型中有抗肿瘤潜力。
NEC 与高分化 NET 分库对照对照分级相关药敏差异[2]NEC 更接近上皮癌配方时仍须分皿记录,勿与 PDAC 混库。
把 PDAC SOP 原样当 pNET勿混用混库 / 错误 niche导管腺癌与神经内分泌瘤 niche 与质控不同。

一句话造模

NET 小团 → dome → EGF/FGF2 niche → 短期 Y-27632 → 机械传代 → CgA/Syn → 药敏。

流程概览

  1. 伦理 + 冷链;记录部位(胰 / 小肠 / 结直肠等)、分级(G1–G3 / NEC)与功能状态
  2. 剔除坏死;胶原酶 ± Dispase 至小团;血性短时裂红(MC427)
  3. 基质胶 dome;EGF / FGF2 ± R-spondin / Wnt;勿套 PDAC 高 Wnt/FGF10 默认方[[1]][[2]]
  4. 短期 Y-27632;观察实性 / 半囊状生长
  5. 换液 2–3 天;机械传代;NET 与 PDAC / 胰岛对照分皿
  6. Chromogranin A、Synaptophysin;支原体;与原发灶对照
  7. 靶向 / GSK3 等药敏设溶媒;体内成瘤走移植 SOP,不是本页

第 1 步 · 取材与消化

  1. 记录分级与功能状态;与 PDAC 标本分器械。
  2. 胶原酶(MC412)± Dispase(MC413)至小团;血性短时裂红(MC427)。
  3. 勿打成纯单细胞。

第 2–3 步 · niche 与扩增

  1. 以 EGF / FGF2 起步;Wnt/Rspo 按文献可选[1][2]。
  2. 勿默认套用 PDAC Wnt/FGF10/胃泌素全套。
  3. 机械传代;记录代数与基质批号。

第 4–5 步 · 质控与药敏

  1. CgA / Synaptophysin;支原体;与原发灶对照。
  2. 靶向 / GSK3 臂设溶媒[1]。
  3. 体内验证走移植 SOP,不是本页。

Niche 试剂起点(须滴定)

下表为文献常见起点,不是本站处方浓度。

组分角色站内
EGF + FGF2 ± R-spondinpNET / GEP-NET 核心[1][2]打开 →
CHIR-99021(GSK3 对照臂)非默认扩增;药敏另皿[1]打开 →
Y-27632 短期接种窗口打开 →
红细胞裂解液血性标本短时裂红打开 →
胶原酶 II 型组织 / 肿瘤消化至上皮小团打开 →
Dispase II与胶原酶联用温和解离打开 →
类器官冻存液建库冻存打开 →

本流程小分子货号

深链到在售货号;价格均为询价。生长因子(EGF/Noggin/R-spondin 等)属蛋白类,见蛋白/酶/多肽分类。

化合物SKU用途价格
Y-27632MCK1042ROCK 抑制;接种/传代后短期提高存活询价
CHIR-99021MCK1040GSK-3 抑制 → Wnt 激活;干性/谱系诱导询价
A83-01MCK1825ALK4/5/7;减少间质长满询价
烟酰胺MCK1836人上皮类器官配方常见询价

本流程蛋白 / 多肽货号

生长因子与胃泌素等深链货号;价格均为询价。活性与复溶以批号 COA 为准。

产品SKU用途类型价格
重组人 EGFMGF30001上皮扩增核心生长因子蛋白询价
重组人 FGF2MGF30006前列腺等上皮 niche;脑 / PSC 诱导也常见蛋白询价

本流程质控抗体货号

建库 / 药敏前 IHC·IF 常用标记;深链现有抗体货号。稀释与种属以说明书为准。

标记产品SKU用途
CgAChromogranin A 抗体MCAB6701神经内分泌瘤质控;pNET / GEP-NET
SynaptophysinSynaptophysin 抗体MCAB5245神经内分泌突触泡蛋白质控
Ki-67Ki-67 抗体B10315增殖指数;药敏前后对照

本流程培养补充剂货号

B-27 / N-2 / 谷氨酰胺 / 双抗等现有细胞培养货号;浓度按说明书与文献滴定。

产品SKU用途
Advanced DMEM/F12 培养基MC410无血清类器官基底培养基
B-27 补充剂 50×MC317无血清上皮 / 神经类器官基底补充
稳定型谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺,200 mM)MC301Advanced DMEM/F12 体系谷氨酰胺来源
青霉素-链霉素双抗溶液 100×MC306建库早期防污染;稳定后可评估撤除
类器官基底膜基质(BME)MC411dome / sandwich 三维包埋
胶原酶 II 型MC412组织 / 肿瘤消化至上皮小团
Dispase IIMC413与胶原酶联用温和解离
Accutase 温和解离液MC414传代温和酶解备选
类器官冻存液MC415建库冻存
支原体检测试剂盒MC416建库前无菌质控
HEPES 缓冲液(1 M)MC305类器官培养基缓冲;按配方终浓度加入
胶原酶 IV 型MC421解离备选;可与 II 型对照
类器官原代抗菌添加剂(Primocin 类)MC423原代 / PDO / PSC 建库早期防污染
超低吸附 96 孔板MC425EB 形成 / 球体 / 药敏读板
圆底(U 底)96 孔板MC430球体沉降 / 共培养读板;与 ULA 分工
红细胞裂解液MC427血性标本消化后裂红

药敏 ↔ 球体 / 造模 / 移植分工

本页 PDO 药敏在基质胶 dome 内完成,读数与给药窗口按本 SOP。细胞株球体 / 2D 活力读数走球状体专页与细胞造模;体内成瘤与 PDX 走细胞移植模型。勿把三条流程的步骤混用。

参考文献

  1. [1] Anti-tumor potential of combinatory GSK3 inhibition in human 3D models of pancreatic neuroendocrine tumors and patient-derived GEP-NET primary cultures. Endocr Relat Cancer. 2025. PMID 40862396
  2. [2] Patient-Derived Organoid Models of Human Neuroendocrine Carcinoma. Front Endocrinol. 2021. PMID 33776923
免责声明:仅供科研参考(RUO),不构成临床诊疗或实验室法定操作规范。人体组织须取得伦理批件。文内 [n] 对应参考文献。浓度与消化时间必须本地滴定。