细胞培养 / 类器官 / 肠类器官

成体肠类器官 protocol

成体小肠/结肠隐窝类器官：EDTA 释出隐窝 → 基质胶包埋 → EGF / Noggin / R-spondin（人结肠常加 Wnt3a）维持 Lgr5 扩增。浓度按 Sato 文献滴定。[1][2][3]

适用场景

本页是成体上皮隐窝扩增，不是 PSC 肠管、也不是结直肠癌 PDO（后者见专页）。

用途适合度主要读出说明
成体小肠 / 结肠隐窝扩增推荐出芽结构、传代成功率、Lgr5 相关读出[1][3]小鼠小肠经典 ENR；人结肠对 Wnt 更依赖[[2]]。
结直肠癌 PDO对照肿瘤形态与药敏APC 突变株常可撤 Wnt；步骤见结直肠癌 PDO 专页。
PSC 衍生肠管 / 类器官芯片勿混用分层与蠕动样结构诱导窗口（Activin → FGF/Wnt）与成体隐窝不是同一本书。

一句话造模

隐窝释出 → dome → ENR（人结肠 + Wnt）→ 短期 Y-27632 → 5–7 天传代 → 出芽形态 + 支原体后建库。

流程概览

  1. 伦理批件（人）或 IACUC（鼠）；冰上取材
  2. 剥离黏膜；EDTA 释出隐窝（勿打成单细胞）
  3. 过筛计数隐窝；冰上混基质，点 dome
  4. 加入 ENR 培养基；人结肠补 Wnt3a / 烟酰胺等[[2]]
  5. 接种 48–72 h 内用 Y-27632；之后撤药
  6. 每 2–3 天换液；小鼠约 5–7 天机械传代
  7. 出芽/囊状形态；支原体后冻存
  8. 分化实验需撤 Wnt/R-spondin 或换分化配方，勿与扩增混用

第 1 步 · 隐窝分离

  1. 鼠：取小肠/结肠，冷 PBS 冲净内容物，纵剖去绒毛侧黏液。
  2. 人：黏膜与固有层分离后同样冰上操作，当天接种[2]。
  3. 2–5 mM EDTA、4 °C 摇 20–40 min 释出隐窝；剧烈吹打会打成单细胞、成功率下降[3]。
  4. 70 μm 过筛，低速离心收集隐窝。

第 2 步 · 包埋

  1. 按目标密度（常见每 50 μL 胶数十至数百隐窝）冰上混匀。
  2. 点 dome，37 °C 凝固后加预热 ENR，勿冲散。

第 3 步 · ENR / Wnt niche

  1. 小鼠小肠：EGF + Noggin + R-spondin 即可长期扩增[1]。
  2. 人结肠：补 Wnt3a、烟酰胺，常加 A83-01 / p38 抑制[2]。
  3. Y-27632 仅用于接种或传代后 1–3 天。
  4. 分化（杯状/肠内分泌等）时撤 Wnt 或换分化培养基，与扩增分皿。

第 4 步 · 传代与建库

  1. 出芽拥挤或中心发暗时机械破碎成微簇，1:3–1:6 重新包埋[3]。
  2. 冻存用类器官相容冻存液；复苏可加一天 Y-27632。
  3. 质控：出芽形态、支原体；人源有条件做 STR。

Niche 试剂起点（须滴定）

下表为文献常见起点，不是本站处方浓度。

组分角色站内
Advanced DMEM/F12 + B-27 ± N-2 + 双抗基底打开 →
隐窝释放 EDTA 工作液成体隐窝释出[3]打开 →
基底膜基质（BME）dome 包埋打开 →
EGF + Noggin + R-spondin-1（ENR）小鼠小肠核心三因子[1]打开 →
Wnt3a（人结肠 / 近端扩增）人结肠常不可缺[2]打开 →
烟酰胺、A83-01、SB202190（人）Sato 人上皮体系常见[2]打开 →
Y-27632隐窝接种后短期打开 →
胶原酶 II 型组织 / 肿瘤消化至上皮小团打开 →
Dispase II与胶原酶联用温和解离打开 →
类器官冻存液建库冻存打开 →

本流程小分子货号

深链到在售货号；价格均为询价。生长因子（EGF/Noggin/R-spondin 等）属蛋白类，见蛋白/酶/多肽分类。

化合物SKU用途价格
Y-27632MCK1042ROCK 抑制；接种/传代后短期提高存活询价
SB202190MCK1279p38 抑制；人上皮类器官稳定询价
DAPTMCK1021γ-分泌酶 / Notch；分化窗口常用询价
A83-01MCK1825ALK4/5/7；减少间质长满询价
IWP-2MCK1830Porcupine；阻断 Wnt 分泌；CRC Wnt 撤除对照询价
XAV939MCK1831Tankyrase；抑制 Wnt；CRC / 肠对照臂询价
烟酰胺MCK1836人上皮类器官配方常见询价
按本表询价全部小分子

本流程蛋白 / 多肽货号

生长因子与胃泌素等深链货号；价格均为询价。活性与复溶以批号 COA 为准。

产品SKU用途类型价格
重组人 EGFMGF30001上皮扩增核心生长因子蛋白询价
重组人 NogginMGF30002BMP 拮抗；ENR / PDO niche；双 SMAD 神经诱导常用蛋白询价
重组人 R-spondin-1MGF30003Wnt 放大；长期扩增蛋白询价
重组人 Wnt3aMGF30004人结肠 / CRC 建库 / 导管 / 胃 / 卵巢 / 肝 Wnt蛋白询价
按本表询价蛋白 / 酶 / 多肽分类

本流程质控抗体货号

建库 / 药敏前 IHC·IF 常用标记；深链现有抗体货号。稀释与种属以说明书为准。

标记产品SKU用途
CK20CK20 抗体MCAB5332结直肠 / 部分胃 / 尿路 / 食管上皮质控
CDX2CDX2 抗体MCAB5117肠谱系转录因子；CRC / 肠
EpCAMEpCAM 抗体MCAB5377广谱上皮；多组织 PDO 通用
按本表询价抗体分类

本流程培养补充剂货号

B-27 / N-2 / 谷氨酰胺 / 双抗等现有细胞培养货号；浓度按说明书与文献滴定。

产品SKU用途
Advanced DMEM/F12 培养基MC410无血清类器官基底培养基
B-27 补充剂 50×MC317无血清上皮 / 神经类器官基底补充
N-2 补充剂 100×MC318神经 / 部分上皮配方常用；与 B-27 按体系选用
稳定型谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，200 mM）MC301Advanced DMEM/F12 体系谷氨酰胺来源
青霉素-链霉素双抗溶液 100×MC306建库早期防污染；稳定后可评估撤除
类器官基底膜基质（BME）MC411dome / sandwich 三维包埋
胶原酶 II 型MC412组织 / 肿瘤消化至上皮小团
Dispase IIMC413与胶原酶联用温和解离
Accutase 温和解离液MC414传代温和酶解备选
类器官冻存液MC415建库冻存
支原体检测试剂盒MC416建库前无菌质控
HEPES 缓冲液（1 M）MC305类器官培养基缓冲；按配方终浓度加入
胶原酶 IV 型MC421解离备选；可与 II 型对照
隐窝释放用 EDTA 工作液（类器官）MC422成体肠隐窝 EDTA 释出
类器官原代抗菌添加剂（Primocin 类）MC423原代 / PDO / PSC 建库早期防污染
超低吸附 96 孔板MC425EB 形成 / 球体 / 药敏读板
圆底（U 底）96 孔板MC430球体沉降 / 共培养读板；与 ULA 分工
按本表询价培养补充剂分类

参考文献

  1. [1] Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009. PMID 19329995
  2. [2] Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 2011. PMID 21841781
  3. [3] Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: methodology and applications. Nat Protoc. 2013. PMID 23787894

相关入口

其他分步 SOP

免责声明：仅供科研参考（RUO），不构成临床诊疗或实验室法定操作规范。人体组织须取得伦理批件。文内 [n] 对应参考文献。浓度与消化时间必须本地滴定。