细胞培养 / 类器官 / 肾 / 肾小管样

人肾肾小管样类器官(tubuloid)建库 protocol

成人肾组织或尿源上皮建立长期可扩增的肾小管样类器官(tubuloids):包埋后用 EGF / FGF / R-spondin / A83-01 等配方维持,读出肾小管标记;RCC PDO 另立分皿。[1][2]

适用场景

肾 tubuloid / 可选 RCC PDO,不是 iPSC 多谱系肾类器官全程,也不是 786-O 球体。

用途适合度主要读出说明
成人肾 / 尿源 tubuloid 疾病建模推荐管状结构、肾小管标记、感染 / 遗传课题[1]Schutgens tubuloid 可长期扩增并用于个性化建模。
RCC 手术标本 PDO(分皿)对照肿瘤标记 / 药敏与正常 tubuloid 严格分库;配方按文献滴定。
786-O / A498 球体冒充肾类器官勿混用球体直径细胞株球体不是 tubuloid / PDO。

一句话造模

肾组织 / 尿上皮 → dome → EGF/Rspo niche → 短期 Y-27632 → 机械传代 → 肾小管标记 →(可选)RCC 分皿。

流程概览

  1. 伦理 + 冷链;记录取材(皮质 / 髓质 / 尿)与是否肿瘤
  2. 正常肾:酶切至小团;尿源:离心富集上皮团;血性短时裂红(MC427)
  3. 基质胶 dome;tubuloid 配方(EGF、FGF、R-spondin、A83-01 等)[[1]]
  4. 短期 Y-27632;观察管状 / 囊状结构
  5. 换液 2–3 天;机械传代;记录代数与基质批次
  6. 肾小管标记(CK7 / EpCAM 等按课题);支原体
  7. RCC / 肿瘤 PDO:另立分皿与配方,勿与正常 tubuloid 混库
  8. iPSC 多谱系肾诱导另立课题;体内成瘤走移植 SOP

第 1 步 · 取材与消化

  1. 正常与肿瘤器械分开;记录皮质 / 髓质。
  2. 酶切至小团;尿标本离心富集;血性短时裂红(MC427)。
  3. 勿打成纯单细胞。

第 2–3 步 · tubuloid 扩增

  1. 按 Schutgens 类配方起步[1];观察管状形态。
  2. 机械传代优先;记录代数。
  3. RCC 标本另开皿,勿与正常混库。

第 4–5 步 · 质控与边界

  1. CK7 / EpCAM 等肾小管 / 上皮读出;支原体。
  2. 本页不是 iPSC 多谱系肾诱导(Takasato 等另立)。
  3. 体内肾原位成瘤走 786-O / A498 等移植 SOP。

Niche 试剂起点(须滴定)

下表为文献常见起点,不是本站处方浓度。

组分角色站内
EGF + R-spondin + FGF(按文献)tubuloid 核心[1]打开 →
A83-01抑 TGF-β / 间质打开 →
烟酰胺(常见)人上皮稳定打开 →
Y-27632 短期接种窗口打开 →
红细胞裂解液血性标本短时裂红打开 →
胶原酶 II 型组织 / 肿瘤消化至上皮小团打开 →
Dispase II与胶原酶联用温和解离打开 →
类器官冻存液建库冻存打开 →

本流程小分子货号

深链到在售货号;价格均为询价。生长因子(EGF/Noggin/R-spondin 等)属蛋白类,见蛋白/酶/多肽分类。

化合物SKU用途价格
Y-27632MCK1042ROCK 抑制;接种/传代后短期提高存活询价
A83-01MCK1825ALK4/5/7;减少间质长满询价
烟酰胺MCK1836人上皮类器官配方常见询价

本流程蛋白 / 多肽货号

生长因子与胃泌素等深链货号;价格均为询价。活性与复溶以批号 COA 为准。

产品SKU用途类型价格
重组人 EGFMGF30001上皮扩增核心生长因子蛋白询价
重组人 R-spondin-1MGF30003Wnt 放大;长期扩增蛋白询价
重组人 FGF2MGF30006前列腺等上皮 niche;脑 / PSC 诱导也常见蛋白询价
重组人 FGF10MGF30007前列腺 / 胰腺 / 乳腺 / 肺 / 胃 / 卵巢 / 肝 / 内膜 / 肾 niche蛋白询价

本流程质控抗体货号

建库 / 药敏前 IHC·IF 常用标记;深链现有抗体货号。稀释与种属以说明书为准。

标记产品SKU用途
EpCAMEpCAM 抗体MCAB5377广谱上皮;多组织 PDO 通用
PAX8PAX8 抗体MCAB5911卵巢 / 苗勒管 / 内膜 / 肾来源上皮质控
CK7CK7 抗体MCAB5547胆管 / 尿路 / 部分肾小管 / 食管 / 甲状腺 / 间皮上皮质控

本流程培养补充剂货号

B-27 / N-2 / 谷氨酰胺 / 双抗等现有细胞培养货号;浓度按说明书与文献滴定。

产品SKU用途
Advanced DMEM/F12 培养基MC410无血清类器官基底培养基
B-27 补充剂 50×MC317无血清上皮 / 神经类器官基底补充
稳定型谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺,200 mM)MC301Advanced DMEM/F12 体系谷氨酰胺来源
青霉素-链霉素双抗溶液 100×MC306建库早期防污染;稳定后可评估撤除
类器官基底膜基质(BME)MC411dome / sandwich 三维包埋
胶原酶 II 型MC412组织 / 肿瘤消化至上皮小团
Dispase IIMC413与胶原酶联用温和解离
Accutase 温和解离液MC414传代温和酶解备选
类器官冻存液MC415建库冻存
支原体检测试剂盒MC416建库前无菌质控
HEPES 缓冲液(1 M)MC305类器官培养基缓冲;按配方终浓度加入
胶原酶 IV 型MC421解离备选;可与 II 型对照
类器官原代抗菌添加剂(Primocin 类)MC423原代 / PDO / PSC 建库早期防污染
超低吸附 96 孔板MC425EB 形成 / 球体 / 药敏读板
圆底(U 底)96 孔板MC430球体沉降 / 共培养读板;与 ULA 分工
红细胞裂解液MC427血性标本消化后裂红

参考文献

  1. [1] Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 2019. PMID 30833775
  2. [2] Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 2015. PMID 26466099
免责声明:仅供科研参考(RUO),不构成临床诊疗或实验室法定操作规范。人体组织须取得伦理批件。文内 [n] 对应参考文献。浓度与消化时间必须本地滴定。